乙醇沉淀法提取葡萄多糖的研究

摘要：利用乙醇沉淀法提取葡萄多糖。研究表明此法提取葡萄多糖的条件为: 温度 90 ℃, 时间 2 h, 料液体积比 1∶2, 次数为 3。在提取液浓缩至原体积 1 / 10 的基础上用 6 倍体积的体积浓度95 %乙醇进行沉淀。根据提取工艺可使葡萄多糖的提取率达到 99.9 %。

葡萄(Vitis.L.)系葡萄科葡萄属植物, 是世界性水果, 有“水果皇后”美誉。葡萄中含有多种易于被人体吸收的物质, 性味甘、酸、平, 入肺、脾、肾经, 有补气血, 强筋骨, 利小便, 滋肾宜肝之功效, 对神经衰弱、疲劳过度、消化不良、心悸盗汗、浮肿也有疗效, 因此具有很高的营养及保健价值。其中富含的多糖是非细胞类物质, 对正常细胞无毒副作用且具有多种生物活性, 能够激活免疫细胞、提高机体免疫功能, 并能够抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、促进核酸与蛋白质的生物合成,近年来已经引起人们大的重视。为此, 我们对葡萄多糖的提取工艺条件进行了探讨, 以期为更好地利用葡萄资源提供重要的科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜葡萄: 购自市场, 要求颗粒饱满、无腐败变质。

1.2 试剂与设备

葡萄糖标准样品; 无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、苯酚(重结晶)、硫酸、氯仿、正丁醇等为分析纯。

HJ- 5 型多功能搅拌器 ( 常州市华普达教学仪器有限公司) 、DK- 98- 1A 电热恒温水浴锅 ( 上海洪纪仪器设备有限公司) 、721 分光光度计 ( 上海第三分析仪器厂) 、LG10- 2.4A 高速离心机 ( 北京医用离心机厂) 、真空恒温干燥箱 ( YB- IA 天津生产) 、电子天平。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄多糖的提取工艺:

定量新鲜葡萄去梗、清洗→搅拌、打浆→热水提取、分离多糖→离心 ( 3 000 r / min, 10 min ~ 15min) →乙醇沉淀、洗涤→脱脂、脱蛋白→冷冻干燥→粗多糖

上述工艺中水提水温为 85 ℃, 采用石油醚脱脂, 脱蛋白则采用 Sevage 法。

1.3.2 葡萄多糖含量的测定

多糖含量用总糖含量表示, 以葡萄糖作为标准品(用 0.9 的系数校正), 用硫酸 – 苯酚法测总糖。公式如下:

多糖提取率 =多糖含量葡萄原料质量×100%

2 结果与讨论

2.1 乙醇对葡萄多糖提取率的影响

称取 4 份新鲜葡萄, 每份 250 g。破碎打浆后在温度为 85 ℃、时间为 2.0 h、料液比为体积 1∶2的条件下用水浸提多糖。离心后,合并两次提取液,真空浓缩至原体积的 1 / 10 后分别用 2 倍、4 倍、6倍、8 倍体积浓度 95 %乙醇进行沉淀。重复上述操作 2 次, 将沉淀物干燥称量, 计算提取率, 以比较不同体积浓度 95 %乙醇溶液用量对葡萄多糖提取率的影响。乙醇用量对葡萄多糖提取率有显著影响。在较低倍数时, 葡萄多糖提取率随乙醇体积倍数的增加而显著上升, 而 6 倍、8 倍的提取率相差不大。考虑到多糖提取率以及节省乙醇用量、分离的难易程度等因素, 该实验选择用 6 倍体积的体积浓度 95 %乙醇来沉淀提取葡萄多糖。

2.2 料液体积比对葡萄多糖提取率的影响

称取 5 份新鲜葡萄, 每份 250 g, 分别取五种料液体积比 ( 1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3) ,浓缩后的提取液用 6 倍体积浓度 95 %的乙醇进行沉淀并浸提。重复操作 2 次, 将沉淀物干燥称量, 计算提取率, 以比较不同料液比对葡萄多糖提取率的影响。

料液体积比对葡萄多糖提取率无显著影响。料液体积比在 1∶1 至 1∶3 之间时, 葡萄多糖提取率随料液比的增大而缓慢增大。

由于料液体积比较大, 会增加真空浓缩的工作量,所以以选择 1∶2 的料液体积比为宜。

2.3 提取时间对葡萄多糖提取率的影响

称取 5 份新鲜葡萄, 每份 250 g。采用五个不同的提取时间 ( 分别为 1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h) , 浓缩后的提取液用 6 倍体积浓度 95 %的乙醇进行沉淀并浸提。重复操作 2 次, 将沉淀物干燥称量, 计算提取率, 以比较不同时间对葡萄多糖提取率的影响。浸提时间对葡萄多糖提取率的影响不显著。葡萄多糖的提取率随时间的延长而有所增加, 但增长的幅度不大, 甚至在时间过 2.0 h后还略有下降。这是由于葡萄多糖在水溶液中溶解和扩散达到了平衡而使多糖提取率变化趋缓。考虑到提取率与节约时间及能耗的关系, 以 2 h 的提取时间比较合适。

2.4 提取温度对葡萄多糖提取率的影响

在料液体积比和提取时间相同的前提下, 采用5 个不同温度 ( 50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和 90 ℃)对葡萄多糖进行提取试验。

温度对葡萄多糖提取率有显著的影响, 随着温度的升高, 葡萄多糖的提取率逐渐增大, 90 ℃条件下的提取率是 50 ℃时提取率的近 3倍。在 60 ℃～80 ℃之间曲线的斜率逐渐增大, 而后曲线斜率逐渐减小, 温度高于 90 ℃时, 多糖提取率的增加量已不显著且蛋白质已溶出, 增加了去蛋白的难度和工作量, 另外升高温度至沸腾在长时间浸提条件下可能会影响多糖活性, 所以浸提温度不宜过高。而低温浸提虽然对多糖活性影响小, 但是提取率比较低。因此, 提取温度定在 90 ℃较为合理。

2.5 提取次数对葡萄多糖提取率的影响

称取 4 份新鲜葡萄, 每份 250 g。改变次数为1 次、2 次、3 次、4 次, 浓缩后的提取液用 6 倍体积浓度 95 %的乙醇进行沉淀浸提。重复上述操作 2次, 将沉淀物干燥称量, 计算得率, 以比较不同次数对葡萄多糖提取率的影响。随着浸提次数的增加, 多糖得率也在增加, 但是浸提 4 次时多糖得率不再增加, 说明 3 次浸提已经将绝大部分葡萄多糖提取出来, 因此确定浸提 3 次为浸提次数。

2.6 葡萄多糖含量的测定

以葡萄糖为标准, 采用硫酸 – 苯酚法, 在 490nm处测定其吸光值(A490 nm), 求得标准曲线的回归方程为ρ = 91.026×A490nm- 6.0350 (r = 0.9994)

式中: ρ———表示多糖质量浓度; A———表示吸光度。

将乙醇沉淀后的葡萄多糖用蒸馏水溶解, 按标准曲线显色测定 A490 nm值, 由回归方程计算含量。

葡萄多糖含量为 6.73 g / 100 g ( 以葡萄糖计) , 加样测定平回收率为 99.9 % 。

来源：惠合浓缩器