声波辅助提取甘薯叶中绿原酸的工艺研究

摘要：为了优化声波辅助提取甘薯叶绿原酸的工艺条件，提高甘薯叶绿原酸的提取率，本文通过单因素试验和正交试验，考察乙醇浓度、料液比、声时间和声温度四个因素对甘薯叶绿原酸提取率的影响。对结果进行方差分析，显示提取条件为：乙醇浓度 60%，料液比 1∶30，声时间 50min，声温度 50℃。提取效果的影响主次为：乙醇浓度>料液比>温度>声时间。
绿原酸是一种缩酚酸，属酚类化合物，是植物在有氧呼吸过程中，经莽草酸途径形成的一类苯丙素类化合物，具有很强的药理活性，对消化、血液和生殖系统疾病有显著疗效。绿原酸类化合物是含有羟基和邻二酚羟基的有机物，易溶于水，乙醇，甲醇和丙酮溶液。 微溶于乙酸乙酯等性溶剂中，难溶于氯仿、乙醚的弱性溶剂。是世界上栽培甘薯面积较大的国家， 甘薯茎叶作为甘薯副产品，资源量非常巨大，为绿原酸的提取提供了充足的原材料 。
目前， 国内报道绿原酸的提取工艺主要有水浸醇沉法和水提声法，半仿生等方法。近年来人们利用声波技术提取植物中的生物碱，黄酮，多糖，皂苷，蒽醌，香豆素等生物活性物质，都表明声波技术比常规提取法费时少， 得率高且对其生理活性基本没有影响，溶剂使用量相对较少，可降低成本，且提取物化学成分与常规法相比没有变化。 声提取原理是利用声波产生的强烈震动、空化效应、粉碎等作用， 将植物药材中有效成分提取到溶剂之中。本实验是利用声波辅助提取法从甘薯叶中提取绿原酸，通过单因素和正交试验，探索绿原酸的提取工艺，以获得更多的绿原酸，为进一步利用甘薯叶和绿原酸提供理论依据。

1 实验
1.1 材料、仪器与试剂
1.1.1 材料
甘薯叶。
1.1.2 仪器
KD23B-DE 型电子恒温水浴锅，TDL-5C 型离心机，GZX-DH.300-BS-II 电热恒温干燥箱，JA2003 型电子天平，KQ-5200DB 型数控声波清洗器，T6 新世纪紫外可见分光光度计，质机，SHB-3 循环水式多用真空泵。
1.1.3 试剂
绿原酸，C2H5OH，NaOH，HCl。
1.2 试验方法
1.2.1 声波辅助提取法提取工艺流程
新鲜甘薯叶→干燥→粉碎→乙醇浸泡 12h→声波辅助提取→抽滤→减压浓缩→冷沉离心→含量测定
1.2.2 提取条件的单因素试验
通过初步的实验探索，及其对文献查阅，选取以下几因素做单因素试验：不同乙醇浓度、pH 值、料液比、声温度、声时间。在 200W 功率下进行声波提取甘薯叶中的绿原酸， 用布氏漏斗抽滤处理浸提液，采用薄膜真空旋转蒸发仪处理至无乙醇味，回收乙醇。将浓缩液于 4℃冷藏 24h 之后 3000r/min 离心 10min，取上清液，沉淀洗涤再离心，合并上清液。测定离心液 OD 值， 根据 OD 值大小选择适合的工艺条件。
1.2.3 正交试验设计
在单因素试验的基础上， 在乙醇溶液的 pH 为4.0 的条件下，对乙醇浓度，料液比，声时间，声温度四个因素进行设定（表 1），以绿原酸提取率为考察指标进行四因素三水平 L9（34）正交试验，通过统计分析得出提取绿原酸的工艺条件。
1.2.4 绿原酸含量的测定方法
1.2.4.1 绿原酸标准曲线的测定
用天平准确称取绿原酸标准品 5.00mg，用50%的乙醇溶解定容于 100mL 容量瓶，摇匀，得绿原酸标 准 液 50μg/mL。 精 确 吸 取 0.00mL，1.00mL，2.00mL，3.00mL，5.00mL，7.00mL 上述标准液分别置于 10mL 容量瓶，加 50%的乙醇溶液定容至刻度。用50μg/mL 绿原酸与紫外可见分光光度计扫描波长，得到绿原酸的较大吸收峰 328.8nm。 以绿原酸标准样品浓度（μg/mL）为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.4.2 样品含量的测定
准确吸取冷沉离心后处理的甘薯叶提取液0.1mL 于 1000mL 容量瓶中， 加 50%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀。取容量瓶中的提取液稀释 20 倍，用不含提取物的溶剂作空白对照。 在 328.8nm 下测定吸光度， 根据测定的吸光度和浓度的关系方程算出样品中绿原酸的含量。
绿原酸含量（%）=X×10-6×1000×稀释倍数0.1×m×100%
式中：X———由标准曲线计算得出绿原酸含量，μg；
m———样品质量，g。

2 结果与分析
2.1 提取条件单因素试验
2.1.1 溶液的 pH 值对提取效果的影响
准确称取干燥后粉碎到 40 目的甘薯叶 5 份，各5g， 用 NaOH，HCl 溶液调节 60%的乙醇溶液 pH 值到 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，按料液比 1∶20（质量/体积）的比例分别加入上述甘薯叶和乙醇溶液，30℃恒温水浴锅浸泡 12h 后， 在 200W 功率下声波辅助提取 30min，声温度 50℃。随着溶剂 pH 值的增加，提取液的OD 值不断降低，绿原酸的提取率也不断减少，这可能是由于绿原酸是一种有机酸，pH 值越高， 绿原酸发生电离、水解，导致绿原酸的得率下降。由试验结果可知绿原酸在酸性条件下 pH 4.0 时提取适合。
2.1.2 乙醇浓度对提取效果的影响
准确称取干燥后粉碎到 40 目的甘薯叶 5 份，各5g， 分别配置 30%，40%，50%，60%，70%的 乙 醇 溶液，用 NaOH，HCl 溶液调节其 pH 值到 4.0，按料液比 1∶20 的比例分别加入上述甘薯叶和乙醇溶液，30℃恒温水浴锅浸泡 12h 后， 在 200W 功率下声波辅助提取 30min，声温度 50℃。随着乙醇浓度的增加，OD 值逐渐增大，当乙醇浓度为 60%时，提取效果较好。但当浓度达到 70%时，OD 值却降低，表明绿原酸的提取率也在减少。这是由于随着溶剂浓度的增加，绿原酸的溶解度增高，当溶剂浓度过一定程度时，绿原酸溶解度降低，提取率减少。可能是因为绿原酸易溶于水，含水乙醇，不溶于油脂等。而且溶剂浓度过高，则会使某些溶质性物质溶出也增多， 这些成分往往同溶剂水分子结合，干扰因素随之增大，给提纯带来困难，导致提取率下降。由试验结果可知 60%的乙醇溶液最为适合。
2.1.3 料液比对提取效果的影响
准确称取干燥后粉碎到 40 目的甘薯叶 5 份，各5g， 用 NaOH，HCl 溶液调节 60%的乙醇溶液 pH 值到 4.0， 分别按料液比 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 加入甘薯叶和乙醇溶液，30℃恒温水浴锅浸泡 12h 后，在 200W 功率下声波辅助提取 30min， 声温度50℃。随着料液比的增大，OD 值先增大后降低， 溶剂量的增大可能导致杂质大量的溶出而导致 OD 值下降，而且使得成本大大增加。由试验结果可知提取绿原酸的最适料液比是 1∶30。
2.1.4 温度对提取效果的影响
准确称取干燥后粉碎到 40 目的甘薯叶 5 份，各5g， 用 NaOH，HCl 溶液调节 60%的乙醇溶液 pH 值到 4.0， 按料液比 1∶20 的比例分别加入上述甘薯叶和乙醇溶液，30℃恒温水浴锅浸泡 12h 后， 分别在20℃，30℃，40℃，50℃，60℃的温度下，以 200W 功率强度声波辅助提取 30min。
随着温度的升高，OD 值随之升高，这是由于，绿原酸在热水中的溶解度更大，但是由于绿原酸的邻二酚羟基结构不稳定， 高温加热易氧化分解， 因此高温及长时间加热不利于绿原酸的提取。由试验结果可知提取绿原酸最适温度为 50℃。
2.1.5 提取时间对提取效果的影响
准确称取干燥后粉碎到 40 目的甘薯叶 5 份，各5g， 用 NaOH，HCl 溶液调节 60%的乙醇溶液 pH 值到 4.0， 按料液比 1∶20 的比例分别加入上述甘薯叶和乙醇溶液，30℃恒温水浴锅浸泡 12h 后， 分别在200W 功率下声波辅助提取 10min，20min，30min，40min，50min，声温度 50℃。随着时间的增长，OD 值逐渐升高，绿原酸提取率增加，提取 40min 和 50min 是变化不大，OD 值趋于稳定， 而且高温浸泡时间过长，绿原酸不稳定。分析可知提取绿原酸最适浸提时间为50min。
2.2 正交试验结果分析
在单因素试验的基础上，在 pH 值为 4.0 的条件下，其他因素进行四因素三水平正交试验。
从正交试验结果与差分析可知，四个因素对甘薯叶中绿原酸提取率的影响大小依次为：乙醇浓度>料液比>温度>声时间，乙醇浓度和料液比对绿原酸的提取率影响为显著水平。 通过差分析结果可知提取方案为A2B2C3D2，提取工艺分别为：乙醇浓度60%，料液比1∶30，声时间50min，声温度50℃。通过实验验证：在此条件下，得到绿原酸得率为 3.42%。

来源：惠合浓缩器