蓝莓叶水溶性和醇溶性提取物的抗氧化作用

摘要：以蓝莓叶为原料，提取了其中的水溶性和醇溶性物质，通过体外化学模拟体系，测定了蓝莓叶水溶性提取物和醇溶性提取物的抗脂质体过氧化、还原力、清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH·自由基的能力。结果表明水溶性提取物和醇溶性提取物均具有抗脂质体过氧化能力、增强还原力、清除羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2-·)﹑DPPH·自由基的能力 ，并且随浓度的增加抗脂质过氧化 、还原力 、清除自由基能力增强 。醇溶性提取物抗脂质过氧化能力强于水溶性提取物，但水溶性提取物清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH·自由基能力强于醇溶性提取物，二者还原力无显著性差异。蓝莓叶提取物具有明显的抗脂质体过氧化作用和清除自由基能力，可作为有效的天然抗氧化剂。

细胞内活性氧自由基产生与清除失去平衡，就会引起一些疾病，包括心血管疾病、动脉硬化、白内障、慢性炎症和癌症等疾病。抗氧化剂可以清除反应的自由基，防止过氧化损伤，具有促进健康的作用，但是人工合成的抗氧化剂可能会对人体有潜在的毒性和环境污染问题。因此具有抗氧化活性的一些植物的次生代谢物质成为研究的热点，在很多植物成分中， 多酚化合物由于具有明显的抗氧化活性和在植物中的广泛分布，引起了人们的注意。

植物中的多酚类物质包括简单的酚类化合物、 黄酮类物质、酚酸、花色苷等。很多酚类化合物具有促进健康的作用，例如抗炎症、抗菌、降血糖等，同时多酚在防止氧化应激损伤上扮演重要角色。

蓝莓，又称越橘、乌饭树，属于杜鹃花科越橘属植物，为常绿或落叶灌木。蓝莓叶全缘或有锯齿，可以药食两用。蓝莓叶中含有蛋白质、纤维素、脂肪酸、微量元素、有机酸、氨基酸、维生素、糖类和多酚类化合物。目前对蓝莓叶提取物的研究主要集中在提取和生物活性方面， 蓝莓叶提取物采用的提取方法有常规溶剂提取法、 微波辅助提取法和超声波辅助提取法。在生物活性方面，发现蓝莓叶提取物有抑制白血病 HL60 细胞的生长的作用。Wang 等研究发现乌饭树叶提取物具有降低糖尿病小鼠血糖的作用。 同时乌饭树叶能明显改善并提高视网膜功能，对视网膜具有明显的保护作用。本文通过体外模拟体系研究蓝莓叶水溶性提取物和醇溶性提取物的抗氧化和清除自由基作用， 这对充分利用蓝莓叶资源具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料

蓝莓叶；丁基羟基茴香醚（BHA）、水杨酸、硫酸亚铁、无水乙醇、过氧化氢、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、磷酸二氢钠 （NaH2PO4）、 磷 酸 氢 二 钠 （Na2HPO4）、 铁 氰 化 钾［K3Fe（CN）6］、三氯乙酸（TCA）、三氯化铁（FeCl3）、三羟甲基氨基甲烷 （Tris）；盐酸、邻苯三酚（焦性没食子酸）、大豆卵磷脂（LLS）、硫代巴比妥酸（TBA）、抗坏血酸；A B-8 大孔树脂。

1.1.2 实验仪器

RRH-100 万能高速粉碎机；FA2410 电子分析天平；UV-2550 型紫外-可见分光光度计；RE-52AA 型旋转蒸发仪；HH-6 数显恒温水浴锅；SHB-III 型循环水真空泵；pHS-25 型酸度计； 柱层析装置；DHG-9038 型电热恒温鼓风干燥箱；真空冷冻干燥机；TD5A-WS 低速离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓叶提取物的制备

将蓝莓叶 50℃烘干， 粉碎后过 40 目筛。 称取20g 蓝莓叶粉末 ，按 1∶20（g/mL）的料液比加入水溶液；另外称取 20g 蓝莓叶粉末，按 1∶20（g/mL）的料液比加入醇溶液，分别在 25℃将其搅动 15min，用超声波提取 1.5h，过滤，收集滤液,50℃旋转蒸发仪浓缩。

通过 Folin-Ciocalteu 法测定多酚含量，NaNO2-Al-NO3比色法测定黄酮含量。蓝莓叶水溶性提取物（WE）、醇溶性提取物（EE）使用前在 4℃避光保存。

1.2.2 抗脂质过氧化能力的测定

分别于试管中依次加入 1mL LLS （卵磷脂）溶液，1mL 0.4mol/L 的 FeSO4溶液、分别量取不同浓度的蓝莓叶水溶性提取物、醇溶性提取物、丁基羟基茴香醚（BHA）各 3mL，混匀。避光于 37℃水浴 60min，加入 2mL TCA-TBA-HCl 混合液 （15g TCA，0.37gTBA，2.1mL 浓盐酸定容至 100mL），90-100℃ 水浴15min，迅速冷却 ，以 3000r/min 离心 10min，取上清液在 535nm 波长处测定吸光度（As）。BHA（丁基羟基茴香醚）作阳性对照。抑制率计算公式如下：抑制率=（A0-AsA0）×100%式中：As 为样品的吸光度；A0为以 1mL 蒸馏水代替 1mL 样品溶液，操作方法同样品管，测得空白管的吸光度。

1.2.3 还原力的测定

参照 Kumarappan 等方法略做修改。在试管中， 依次加入 2.5mL 磷酸盐缓冲液（PBS，0.2mo1/L，pH 6.6）， 分别量取不同浓度的蓝莓叶水溶性提取物、醇溶性提取物、抗坏血酸溶液各 2.5mL 和 2.5mL质量分数 1%的 K3Fe（CN）6溶液，于 50℃水浴保温20min 后，快速冷却，再加入 2.5mL 10% TCA 溶液，3000r/min 离心 10min，取上清液 2.5mL，依次加入2.0mL 蒸馏水，0.5mL 0.1%的 FeCl3溶液，充分混匀，静置 10min 后， 在 700nm 波长处测定其吸光度，吸光度越大表示还原力越强。

1.2.4 清除·OH 能力的测定

利用 H2O2与 Fe2+反应产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在 510nm 波长处有最大吸收。 在反应体系中加入 1mL 10mmol/L的 FeSO4溶液，1mL 10mmol/L 水杨酸溶液 （溶剂为乙醇）后，分别量取不同浓度的蓝莓叶水溶性提取物、醇溶性提取物各 1mL，最后加入 1mL 8.8mmol/LH2O2溶液启动反应，37℃反应 30min，在 510nm 波长处测定各浓度的吸光度。

清除率=[1-Ai-AjA0]×100%式中：A0为用蒸馏水代替样品的吸光度；Ai为加入样品溶液的吸光度；Aj为不加显色剂 H2O2样品溶液的吸光度。

1.2.5 清除超氧阴离子自由基（O2-·）的测定

1.2.5.1 邻苯三酚自氧化的测定

取 50mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）缓冲液 4.5mL，蒸 馏 水 4.2mL， 混 匀 后 在 25℃恒 温 水 浴 中 保 温20min， 取出后立即加入 3mmol/L 邻苯三酚溶液0.3mL（以 10mmol/L HCl 配制 ，空白管用 10mmol/LHCl 代替邻苯三酚的 HCl 溶液），迅速摇匀后倒入比色皿， 每隔 0.5min 在 320nm 处测定溶液的吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加值。

1.2.5.2 样品活性测定

在加入邻苯三酚前，分别量取不同浓度的蓝莓叶水溶性提取物、 醇溶性提取物 1mL， 蒸馏水3.2mL， 然后按 1.2.7 的方法操作, 抗坏血酸作阳性对照，计算清除率。清除率=（ΔA0-ΔA）/ΔA0×100%式中：ΔA0为邻苯三酚自氧化速率；ΔA 为加入样品后邻苯三酚的自氧化速率，单位均为吸光度每分钟的增加值。

1.2.6 清除 DPPH 自由基的测定

参照 Kumarappan 等方法略做修改。分别量取不同浓度的蓝莓叶水溶性提取物、醇溶性提取物2mL 及 2mL 的 DPPH 溶液 （0.2mmol/L）加入同一试管中，摇匀后，在室温暗处放置 30min，分别在 517nm波长处测定吸光度。BHA（丁基羟基茴香醚）作阳性对照。根据公式计算其清除率：

清除率=[1-Ai-AjA0]×100%式中：Ai为加入 2mL 不同质量浓度的样品溶液后 DPPH 溶液的吸光度；Aj为加入 2mL 不同质量浓度样品溶液和 2mL 乙醇的吸光度；A0为加入乙醇后DPPH 溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 蓝莓叶提取物含量

水提取物的提取物总量显著（P<0.05）高于醇提取物的提取物总量，但醇提取物中的多酚含量和黄酮含量显著（P<0.05）高于水提取物中的多酚和黄酮总量。

2.2 蓝莓叶提取物抗脂质过氧化能力

由 Fe2+引发的卵磷脂脂质体体系中， 蓝莓叶水溶性提取物和醇溶性提取物对脂质体过氧化有显著（P<0.05）的抑制作用，抑制率随蓝莓叶提取物浓度的增加而增大， 蓝莓叶醇溶性提取物抗脂质过氧化能力显著（P<0.05）高于蓝莓叶水溶性提取物抗脂质过氧化能力， 但二者低于丁基羟基茴香醚的抗脂质过氧化能力。 蓝莓叶提取物抑制脂质过氧化可能是因为多酚类物质能够和自由基反应或者与多酚螯合金属离子有关。

2.3 蓝莓叶提取物的还原力

抗氧剂的还原力是和它的电子转移有关的，可作为其抗氧化活性的一个重要指标， 二者具有明显的相关性。还原力的测定可检验化合物是否为良好的电子供应体, 它所提供的电子可以使 Fe3+还原为 Fe2+，使体系溶液颜色发生变化，即反映出体系中氧化还原状态的改变。体系溶液吸光度越大，则表示提取物还原力越强，抗氧化效果越佳。在一定质量浓度范围内，蓝莓叶水溶性提取物和醇溶性提取物的还原力随其质量浓度的增加而增强，相关系数（R2）分别为 0.966、0.983。蓝莓叶水溶性提取物和醇溶性提取物均具有较强的还原能力，但低于同质量浓度抗坏血酸的还原力。提取溶剂对还原力有一定影响，醇溶性蓝莓叶提取物的还原力略高于水溶性蓝莓叶提取物还原力，但二者还原力不具有显著性差异。

2.4 蓝莓叶提取物清除羟自由基能力

在众多自由基中，·OH 是最活泼的， 也是毒性最大的自由基，它可以与细胞中的任何生物大分子发生反应产生损害，并且其反应速度快，对生物体危害最大。随着质量浓度的增加，蓝莓叶水溶性提取物和醇溶性提取物对·OH 清除率均呈现上升趋势。水溶性提取物浓度为 0.390mg/mL 时对·OH 清除率达到 50%，而醇溶性提取物对·OH 清除率达到 50%的浓度为 0.597mg/mL。水溶性蓝莓叶提取物和醇溶性蓝莓叶提取物对·OH 的清除能力均弱于抗坏血酸。

2.5 蓝莓叶提取物对超氧阴离子的清除能力

超氧阴离子自由基是人体内最常见的氧自由基， 它能够引起细胞和 DNA 损伤导致各种疾病，因此，在检验抗氧化物质的活性时常把清除超氧阴离子自由基能力作为一个重要指标。随着蓝莓叶提取物浓度的增加，蓝莓叶提取物对 O2-·清除率呈现上升趋势，但相对抗坏血酸，蓝莓叶提取物清除 O2-·的能力较弱，水溶性提取物对 O2-·的半抑制浓度为 0.510mg/mL，醇溶性提取物对 O2-·的半抑制浓度为 0.775mg/mL。

2.6 蓝莓叶提取物清除 DPPH·自由基的能力

DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在 517nm 处有强烈吸收。它被广泛的用于检测自由基清除剂清除自由基能力和抗氧化活性。当体系加入抗氧化剂后，部分的 DPPH·自由基被清除，使吸光度降低，用此法测定蓝莓叶提取物对 DPPH·自由基清除效果。蓝莓叶水溶性提取物和醇溶性提取物对 DPPH·自由基的清除率随着提取物浓度的增加而增强；水溶性蓝莓叶提取物浓度为 0.496mg/mL， 对 DPPH·自由基的清除率达到 50%，醇溶性蓝莓叶提取物的半抑制浓度为 0.566mg/mL。 蓝莓叶水溶性提取物和醇溶性提取物对 DPPH·自由基的清除率均低于同质量浓度的丁基羟基茴香醚对 DPPH·自由基的清除率。

3 结论

多酚类化合物，是指分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分的总称，是自然界来源最丰富的次生代谢产物之一。 蓝莓叶多酚是蓝莓叶中功能性成分之一，通过 Folin-Ciocalteu 法测定水溶提取物多酚含量为 36.6mg/g，醇溶提取物多酚含量为 51.7mg/g。

蓝莓叶水溶性提取物和醇溶性提取物均具有抗脂质体过氧化的能力、增强还原力、清除羟自由基（·OH）、 超氧阴离子自由基、DPPH·自由基的能力，并且随浓度的增加抗脂质过氧化、还原力、清除自由能力增强。醇溶性提取物抗脂质过氧化能力强于水溶性提取物，但水溶性提取物清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH·自由基能力强于醇溶性提取物。

可能是因为蓝莓叶水溶性提取物中除多酚具有清除自由基作用外，水溶性提取物中一些多糖类物质也具有清除自由基作用。蓝莓叶提取物具有明显的抗脂质体过氧化作用和清除自由基能力，是有效的天然抗氧化剂。

来源：惠合浓缩器