氯氰菊酯降解菌DCP016 的分离鉴定及其降解条件优化

摘要：采用底物定向诱导和梯度驯化的方法从农药厂活性污泥中分离到一株氯氰菊酯降解菌 DCP016。通过生理生化及 16S rDNA 分析，将菌株 DCP016 鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。建立响应曲面模型，得到氯氰菊酯降解的优化条件为：氯氰菊酯浓度 30.58mg/L、培养温度 31.80℃、培养基初始 pH 6.29。在此优化条件下，蜡样芽孢杆菌 DCP016 对氯氰菊酯平降解率为 83.47%。氯氰菊酯（Cypermethrin）是目前应用较为广泛和最有发展前景的拟除虫菊酯类农药品种之一。

长期以来，氯氰菊酯一直被认为是一种低毒、高效、杀虫谱广的杀虫剂，但是，最新研究显示，氯氰菊酯可通过环境中长期低剂量接触或通过食物链进入并蓄积于人或哺乳动物体内，引发人类多种慢性疾病。目前，氯氰菊酯已被美国环保局 （EPA）确认为一种潜在的致癌物。因此，消除或降低环境和农产品中氯氰菊酯的残留污染具有重要的现实意义。利用驯化的微生物降解农药是解决环境和农产品中农药残留的有效途径之一。目前，已分离得到的氯氰菊酯降解菌有假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）、产碱菌属（Alcallgenes sp.）和无色杆菌属（Achromobacter sp.）等，但相较于环境中数目巨大的微生物资源来说， 仍有很大的筛选空间。 本实验从农药厂活性污泥中诱导驯化分离得到一株氯氰菊酯降解菌 DCP016， 通过生理生化和 16S rDNA 分析进行菌株鉴定，并对菌株 DCP016降解氯氰菊酯的条件进行了优化， 为进一步研究其降解机理和应用提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌源

活性污泥。

1.1.2 试剂

氯氰菊酯标准品，氯氰菊酯原农药， 乙腈， 溶菌酶、Bacteria DNA Kit 提取试剂盒等，其余试剂为国产分析纯。

1.1.3 农药母液

用无水乙醇将一定量的氯氰菊酯原农药溶解并定容至浓度为 10g/L。

1.1.4 仪器

Waters 高效液相色谱仪，MyCycler PCR 仪、凝胶成像系统、Pow-erPac Basic 电泳仪。

1.2 培养基

1.2.1 基础盐培养基（MM）

KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，NaCl 0.5g，（NH4）2SO41.5g，MgSO40.2g，蒸馏水 1000mL，添加适量氯氰菊酯母液至所需浓度，pH 7.5，121℃灭菌 15min，添加1.5%（w/v）琼脂粉为对应固体培养基。

1.2.2 LB 培养基

酵母膏 5.0g，胰蛋白胨 10.0g，氯化钠 10.0g，蒸馏水 1000mL， 添加适量氯氯氰菊酯母液至所需浓度，pH 7.0，121℃灭菌 15min，添加 1.5%（w/v）琼脂粉为对应固体培养基。

1.3 降解菌的分离与筛选

1.3.1 降解菌的分离

取 5.0g 菌源土样加入分别含 100mg/L 氯氰菊酯的 MM 和 LB 培养基中 （三角瓶装液量为 20mL/100mL），30℃恒温振荡（180r/min）培养 5d 后取培养液接入氯氰菊酯浓度为 200mg/L 的 MM 或 LB 培养基中恒温振荡 （30℃，180r/min）培 养 5d，参 照 文献方法逐级提高氯氰菊酯浓度至 800mg/L。取最末级培养液进行适当稀释， 于含 100mg/L 氯氰菊酯的 MM 和 LB 平板上涂布，恒温培养（30℃）3d 后挑取单菌落进行划线分离直至得到单菌落， 将得到的纯化菌株用甘油于-80℃冷冻保存。

1.3.2 降解菌的筛选

通过对氯氰菊酯降解率的计算， 筛选理想降解菌株。 采用 HPLC 法检测降解体系中氯氰菊酯的残留量， 空白对照为添加同浓度氯氰菊酯未接菌的培养液。

降解率（%）=［（c0－c1）/c0］×100

式中：c0———空白对照中氯氰菊酯浓度（μg/mL）；

c1———降解体系中氯氰菊酯浓度（μg/mL）。

1.4 降解菌的鉴定

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版对理想降解菌株的形态学和生理生化特征进行检测；参照文献方法进行 16S rDNA 系统发育分析， 菌株系统发育树的构建采用 MEGA 4.0 软件。

1.5 氯氰菊酯的检测

参照文献方法进行样品前处理，色谱条件为：Comatex C18 柱 （5.0μm，150mm ×4.60mm （i.d.））， 流动相为乙腈-纯水（80∶20，v/v），流速为 1.2mL/min，柱温为 25℃，检测波长为 210nm，进样量为 10μL。根据标准曲线方程 Y=10196.4X-6323.1（R2=0.9999）计算氯氰菊酯的降解率。

1.6 氯氰菊酯降解条件的优化

根据前期单因素实验结果， 选取影响降解率的主要因素为氯氰菊酯浓度（X1）、菌株培养温度 （X2）和降解体系初始 pH（X3）为自变量，以氯氰菊酯降解率（Y）为响应值，采用 Box-Behnken 法，分析主效应因素间的交互作用， 确定菌株降解氯氰菊酯的优化条件。利用 Minitab 软件处理实验数据，建立有效的响应面模型。其他培养条件为：LB 培养基、摇床转速180r/min、接种量 5%（v/v）、培养时间 96h。

2 结果与讨论

2.1 降解菌的形态及生理生化特性

菌源土样中的微生物经富集驯化， 分离筛选得到菌株 DCP016 可高效降解氯氰菊酯， 其在含氯氰菊酯 20mg/L 的 MM 和 LB 培养基中培养 96h， 氯氰菊酯的降解率分别为 34.5%和 58.6%。 该菌株的菌落表面光滑、圆形、不透明，边缘不整齐，菌落扁平呈白色。

2.2 菌株的系统发育树

将菌株 DCP016 经 PCR 扩增的 16S rDNA 片段提交到 GenBank 数据库，经 BLAST 比对发现，该菌株的 16S rDNA 与蜡样芽孢杆菌 （Bacillus cereus）相似度达 99%以上，选取 Genbank 数据库中与菌株DCP016 的 16S rDNA 基因序列相似性较高菌株的序列，采用邻近法构建其系统发育树，结合菌株形态学及其生理生化特征将其鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。蜡样芽孢杆菌曾被报道为硝基苯等有毒有机污染物的降解菌；徐莲等筛选到一株芽孢杆菌属 GF-3 可高效降解功夫菊酯；辛伟等从茶园植株上分离得到高效降解氯氰菊酯的蜡状芽孢杆菌 TR2。 本实验从农药厂活性污泥中筛选得到一株氯氰菊酯降解菌 DCP016 能在 96h 内快速高效降解氯氰菊酯农药。

2.3 菌株降解氯氰菊酯的优化条件

采 Box-Behnken 响应曲面设计，以氯氰菊酯浓度（X1）、培养温度 （X2）和初始 pH（X3）为自变量 ，以氯氰菊酯降解率（Y）为响应值，得到该菌株降解条件的优化试验设计及响应值。 通过实验数据进行多项式回归分析建立二次响应回归模型，拟合得到氯氰菊酯降解率（Y）Y=-534.698+18.09X1+4.13X2+76.73X3+0.03X1X2+0.42X1X3+0.98X2X3-0.35X12-0.17X22-9.0X32方差分析的显著性检验结果表明，方程的 F 值（79.42）大于 F0.01（9，5），说明方程在 F0.01水平上显著；失拟项 P 值（0.169）大于 0.05，说明失拟项不显著；模型的决定系数（R2）为 0.9838，说明方程的拟合度较好。为求得较大降解率， 分别对模型的各自变量求一阶偏导， 令其为 0， 得出其值点：X1=30.58，X2=31.80，X3=6.29， 即当氯氰菊酯浓度为 30.58mg/L、培养温度为 31.80℃、培养基初始 pH 为 6.29 时，氯氰菊酯降解率的预测值为 83.16%。 经重复验证实验，在优化条件下的氯氰菊酯平降解率为 83.47%（n=3），与预测值基本，说明所建立的响应面模型能够准确预测特定条件下氯氰菊酯的降解率。利用 Minitab 软件程序作出响应曲面图及其等高线图可知。氯氰菊酯浓度和培养基初始pH 在培养温度中心点 35℃时对氯氰菊酯降解率有交互作用，随着氯氰菊酯浓度和初始 pH 的增加，菌株 DCP016 对氯氰菊酯的降解作用呈现先增加后减小的趋势。

来源：惠合浓缩器