不同品种荔枝干多糖酶法提取条件的优化

摘要：以荔枝干为原料，采用纤维素酶提取技术从荔枝干中提取多糖，在酶量、时间、温度、pH 值与料液比的单因素试验基础上，再通过正交试验分析纤维素酶提取荔枝干肉多糖的工艺参数。以上述的工艺参数对糯米糍、白糖罂、桂味、怀枝、和妃子笑进行多糖的提取试验，比较它们的多糖含量。
试验结果表明，纤维素酶提取荔枝干肉多糖的工艺参数是: 料液比为 1∶25，酶解时间为 210 min，酶解温度为 35℃，酶量为 1.6%，pH 值为 6.0。5 个品种荔枝干肉用纤维素酶提取所得多糖含量为: 糯米糍 34.50% ＞ 怀枝 32.73% ＞ 桂味 31.29% ＞ 妃子笑 26.49% ＞ 白糖罂 21.25%。
荔枝 ( Litchi chinensis Sonn.) 是无患子科( Sapindaceae) 荔枝属植物，原产于，至今已有 2000 多年的栽培历史。荔枝果实色泽鲜红，肉质洁白而晶莹，汁多味甜，营养丰富，深受人们的喜爱。世界上仅有等少数几个国家大面积商业化栽培，并且生产期比较集中。荔枝不易贮藏，珍稀而味美，素有“果中之王”的美称。关于荔枝多糖提取方法的报道较少，已报道的提取方法主要有传统的热水浸提法、微波提取以及声波提取。本文选用纤维素酶作为提取剂，在单因素试验的基础上用正交试验分析法对荔枝干肉多糖的酶法提取工艺条件进行优化，以较大限度提高荔枝多糖提取率，以期为后续研究奠定基础，为荔枝多糖的开发利用提供借鉴。

1 试验材料
1.1 材料
市场购买糯米糍、白糖罂、桂味、妃子笑和怀枝 5 个品种的荔枝干。
1.2 试剂
无水乙醇、磷酸氢二钠、柠檬酸为分析纯，纤维素酶10000 u/g( 泰安信得利生物工程有限公司) 。
1.3 仪器
80 － 2 型离心机( 金坛大地自动化仪器厂) ;HH － 6 型数显恒温水浴锅( 常州博远实验分析仪器厂) ; DHG －9023A 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海申光仪器表有限公司) ; ＲE －52AA 型旋转蒸发器( 上海雅荣生化仪器设备有限公司) 。

2 试验方法
2.1 提取荔枝干肉多糖的工艺
荔枝干，除去壳、核，干燥箱烘干，剪成肉糜，称样品，一定料液比，在 60 ℃ 热水浴中浸提 20min，再调 pH 值，加酶，在适当的温度进行酶解相应的时间，酶解结束立即升温至 80 ℃ 灭酶 60min，冷却至室温，抽滤、离心 ( 4000 r / min ) 25min，取上液，真空浓缩，加入浓缩液 4 倍体积的无水乙醇，在冰箱放置24 h 后，离心( 4000 r/min) 25min，取沉淀物，恒温箱中干燥至恒重，荔枝干粗多糖。
2.2 纤维素酶提取荔枝干肉多糖的条件研究
2.2.1 荔枝干肉与蒸馏水料液比的选择试验
准确称取经预处理的荔枝干肉 5.0 g，称取 5组，剪成肉糜，分别以料液比( W/W) 1∶15、1∶20、1∶ 25、1∶ 30、1∶ 35( 液体用蒸馏水) 在 60 ℃ 条件下浸提 20 min。在酶量 1.2% ( W/W) ，pH 值 5.0，温度 50 ℃，酶解 150 min。酶解完迅速升温至80℃ 灭酶 60 min。根据多糖的得率确定纤维素酶提取荔枝干肉多糖的料液比。
2.2.2 酶解时间的选择试验
准确称取经预处理的荔枝干肉 5.0 g，称取 5组，剪成肉糜，以 1∶15 料液比在 60 ℃条件下浸提20 min。分别在酶量 1.2% ( W / W) ，pH 值 5.0，温度 50 ℃下酶解 150、180、210、240 和 270 min。
酶解完迅速升温至 80 ℃灭酶 60 min。根据多糖的得率确定纤维素酶提取荔枝干肉多糖的酶解时间。
2.2.3 酶解温度的选择试验
准确称取经预处理的荔枝干肉 5.0 g，称取 5组，剪成肉糜，以 1∶15 料液比在 60 ℃条件下浸提20 min。分别在酶量 1.2% ( W / W) ，pH 值 5.0，温度是 20、35、50、65 和 80 ℃酶解 150 min。酶解完迅速升温至 80 ℃灭酶 60 min。根据多糖的得率确定纤维素酶提取荔枝干肉多糖的酶解温度。
2.2.4 酶量的选择试验
准确称取经预处理的荔枝干肉 5.0 g，称取 5组，剪成肉糜，以 1∶15 料液比在 60 ℃条件下浸提20 min。分别在 pH 值 5.0、酶量为 0.0、0.4、0.8、1.2 和 1.6% ( W / W) 下酶解 150 min。酶解完迅速升温至 80 ℃灭酶 60 min。根据多糖的得率确定纤维素酶提取荔枝干肉多糖的酶量。
2.2.5 pH 值的选择试验
准确称取经预处理的荔枝干肉 5.0 g，称取 5组，剪成肉糜，以 1∶15 料液比在 60 ℃条件下浸提20 min。分别在酶量 1.2% ( W / W) ，温度 50 ℃ ，pH 值 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 下酶解 150 min。酶解完迅速升温至 80 ℃灭酶 60 min。根据多糖的得率确定纤维素酶提取荔枝干肉多糖的 pH值。
2.2.6 正交试验
综合单因素试验给出的信息，以提取料液比，时间、温度、酶量及 pH 值作为试验因素，运用正交软件程序，采用 6 因素 5 水平进行L25( 56) 正交试验，有一个因素为空列。
2.3 多糖含量的计算
精密吸取样品溶液2 mL 于具塞试管中，然后加入 6%重蒸酚 1.0 mL 及浓硫酸 5.0 mL ，静止10 min，摇匀，室温放置 20 min 以后于 490 nm 测吸光度 ( A) ，由回归方程计算供试液中葡萄糖浓度( C) ，按下式计算样品中荔枝多糖含量。
多糖含量( %) = CDf/W ×100%
式中 C———供试液中葡萄糖浓度/μ
g·mL－ 1D———多糖的稀释因子
f———换算因子( 经试验测定妃子笑荔枝多糖 f 值为1.903，黑叶荔枝多糖 f 值为2.252)
W———供试荔枝渣品的重量 / g
多糖的稀释因子 D 的计算: 荔枝干碎肉经提取后，用蒸馏水反复洗滤渣至 250mL 容量瓶中定容，然后取出 0.4 mL，接着以蒸馏水补充至 2.0mL，然后加入 6% 重蒸酚 1.0 mL 及浓硫酸 5.0mL，所以 D 为 5000。
2.4 不同品种的荔枝干肉多糖含量的测定
精密吸取 5.0 g 荔枝干肉，每个品种 3 份，按2.1 的提取工艺操作，根据( 1) 式计算出每个品种荔枝干肉粗多糖的提取率。
粗多糖提取率( %) =M1M2× 100% ( 1)
式中 M1——— 所得粗多糖的质量 / g
M2——— 荔枝肉的质量 / g

3 试验结果与分析
3.1 纤维素酶提取荔枝干肉多糖的条件研究分析
3.1.1 料液比的选择试验结果
料液比小于1∶30 时，随着料液比的增大，荔枝肉粗多糖的提取率也随着提高;但料液比过1∶30 后，粗多糖提取率出现下降。可能是由于料液比增大，在减压浓缩时多糖容易降解，导致最终算出的提取率下降。因此，料液比选1∶ 30 为佳。
3.1.2 酶解时间的选择试验结果
在240min 前提取率呈上升趋势，但时间大于 240min 时，由于时间的延长，降低了某些反应的活化能，使多糖分子之间、多糖分子与其他分子之间形成新的作用力，增加分子之间碰撞机会，阻止多糖分子溶出，致使提取率的下降明显。因此，酶解时间以 240 min 为佳。
3.1.3 酶解温度的选择试验结果
酶解温度小于 65 ℃ 时，随着浸提温度的提高，荔枝肉粗多糖的提取率随之提高。但当温度大于 65 ℃ 后，随着浸提温度的提高，粗多糖的提取率呈现下降。温度大于 65 ℃后，致使酶出现蛋白变性而减少了酶的作用力，使多糖的提取率减少。因此，浸提温度选 65 ℃为宜。
3.1.4 酶量的选择试验结果
酶量小于0.8% 时，提取率随酶量增加而提高，酶量大于 0.8% 时，随着酶的加多会部分抑制酶的活性，提取率提高趋缓并逐渐出现下降。因此，酶量选 0.8% 为佳。
3.1.5 pH 值的选择试验结果pH 值小于6.0 时，提取率随 pH值的增大而呈逐渐提高趋势，但 pH 值大于 6.0时，提取率明显下降。当 pH 值大于 6.0，酶的活性受到抑制而使多糖的提取率下降。因此，pH 值选6.0 为佳。
3.2 不同品种的荔枝干肉多糖含量的测定
不同品种的荔枝干肉在纤维素酶的作用下提取多糖所得的含量是不同的。利用纤维素酶提取所得多糖由高到低依次是: 糯米糍 34.50% ＞ 怀枝 32.73% ＞桂味 31.29% ＞ 妃 子 笑 26.49% ＞ 白 糖 罂21.25% 。
3.3 纤维素酶提取荔枝干肉多糖正交试验结果分析
5个因素对纤维素酶提取荔枝干肉多糖的影响主次顺序为: C ＞ D ＞ A ＞ B ＞ E，组合为 A3B3C2D5E4，即提取工艺条件为: 料液比为 1 ∶ 25，酶解时间为 210 min，酶解温度为 35 ℃，酶量为 1.6%，pH 值为 6.0。

来源：惠合浓缩器