效应面法与酶法联用提取纹党多糖的优化工艺研究
摘要：通过效应面法与酶法联用工艺提取纹党中的活性物质纹党多糖，以含量为评价指标，用单因素方差分析法研究酶解温度、酶添加量和 pH 对提取纹党多糖含量的影响;采用效应面法和对酶法联用提取工艺条件进行优化。结果显示，优化工艺为:酶解温度为 53.26℃，酶添加量为 0.09g 和 pH 值为 4.63，该工艺条件易于控制、工艺简单、成本低，在此条件下，纹党酶解后纹党多糖的含量最高为38.86% 。
党参［Codonopisis pilosula(Franch)Nannf］，主产于甘肃、山西、陕西、四川等省，是传统名贵中药材，具有补中益气，健脾益肺之功效，主治脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽，内热消渴等症。甘肃省是中药材主要产区之一，党参主要产于甘肃定西、渭源、陇西、甘谷、平凉、岷县、临潭、卓尼、舟曲，以陇南市文县特产的纹党或晶党质量较好，是国家地理标志产品，为甘肃四大名药之一，其种植历史悠久，品质优，种植面积大，陇南文县是纹党较大的生产、加工和销售基地。
多糖在自然界中广泛存在，是构成生命的最基本生物大分子之一，其具有复杂的生物活性与功能。纹党多糖(Codonopsis Pilosula Polysaccha-ride，CPPS) 系其主要有效成分，具有免疫调节、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤等多种作用。随着植物多糖在保健和药理方面的研究和应用关注增多，研究纹党多糖在清除自由基、降血压、抗眩晕、抑菌方面具有独特疗效。相对于其他成分，多糖由于其水溶性和分子量大，给提取纯化带来了困难，近年来有关纹党多糖提取工艺研究的报道较多，但传统提取工艺时间长提取率低，其耗时亦较长。
而且在提取工艺的优化时只是对单一成分进行优化设计，使得纹党资源浪费严重。为此，本文根据纹党多糖特点，用酶法和响应面法联用，进行提取工艺优化研究，节约纹党资源以及综合开发利用提供试验技术，为合理利用纹党资源和工业化生产奠定基础。
1 试验材料与方法
1.1 试验仪器与材料
电子天平 (上海奥豪斯仪器有限公司);SK5200H 型声波清洗仪( 上海科导声仪器有限公司);ＲE52AA 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HH －6 型数显恒温水浴锅(上海千载科技有限公司);TGL － 16G 型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);UV759 型紫外 － 可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司); DＲT － TW型调温电热套(郑州长城科工贸有限公司);DHG－ 9036A 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海精密科学仪器有限公司)。
纹党由甘肃省陇南市文县中寨种植基地提供;苯酚、浓硫酸、葡萄糖 (纯度 ＞ 99.99%，sigam公司)、工业用复合酶(酶活构成为:β － 葡聚糖酶≥300 万 μ/mL，纤维素酶≥40 万 μ/mL，木聚糖酶≥260 万 μ/mL，果胶酶≥ 2 万 μ/mL ) 由和氏璧生物科技有限公司提供;其他试剂为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 纹党多糖的提取流程
将纹党块茎在 50℃ 烘干后将其粉碎，过40目筛，用无水乙醇回流脱脂，再在 50℃时干燥，然后加入一定量的水，在一定温度下添加相应的复合酶进行一定时间的酶解提取，提取液经过减压浓缩得浓缩液，加三倍体积乙醇醇析得粗多糖沉淀，抽滤，沉淀用甲醇多次洗涤，冷冻干燥后得粗多糖样品。
1.2.2 纹党多糖含量的测定方法
试验采用苯酚—硫酸法测定总的纹党多糖含量。先把葡萄糖用苯酚、硫酸试剂处理后，进行紫外扫描，在 489nm 处有较大吸收;再利用标准糖浓度和其用苯酚、硫酸试剂处理后在 489nm 处的吸光度制作标准曲线，再测定待测样品溶液的吸光度，然后根据回归方程计算相应的浓度从而求出多糖含量。苯酚试液的配制:取苯酚 100g，加铝片0.1g 和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集182 ℃馏分，称取 6g，加水溶解，定容于 100 mL 棕色容量瓶(临用前新配)。取多糖干品 10.0mg，用蒸馏水定容于 100 mL 容量瓶。吸取 1.0mL 于带塞试管中，按上述步骤操作，测其吸光度，以标准曲线计算精纹党多糖含量。
纹党多糖的提取率(%)= 样品中多糖的含量稀释倍数 / 样品干重 ×100% 。
1.3 纹党多糖的单因素试验
分别称取 1.0g 纹党参粉末多份，分别置于250 锥形瓶中，用 100 mL 蒸馏水混匀，调节 pH 至4.8，备用。用时添加不同酶剂量搅拌匀后用保鲜膜 封 口，置 于 50 ℃ 恒 温 摇 床 培 养，转 速100 r / min，酶解 24 h，以蒸馏水为空白对照，试验重复 5 次。酶添加量对提取纹党多糖的影响:分别加入 0.02、0.04、0.06、0.08、0.09、0.10、0.11和 0.12 g 工业用复合酶;温度对提取纹党多糖的影响:取备用纹党粉末匀质液体加入工业用复合酶 0.06g，温度设置为 35℃、40℃、45℃、50℃ 、55℃ 、60℃ 和 66℃ 的恒温培养箱内酶解;pH 对提取纹党多糖的影响:在备用纹党粉末匀质液体中分别加入工业用复合酶 0.06 g，以 1 mol/LCH3COOH 溶液和 1mol / L NaOH 溶液调节成 pH值分别为 4.4、4.6、4.7、4.8、5.0、5.2 、5.5 和 6.0的系列梯度进行试验。各单因素试验后测定纹党多糖来确定适合的单因素条件。
2 试验结果与分析
2.1 多糖测定标准曲线的确立
在试验条件下，以标准液浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，得标准曲线，计算回归方程:y =5.1086x +0.0061，相关系数 Ｒ2= 0.9999，线性良好。
2.2 影响纹党多糖的单因素试验
由结果分析可知，45 ～ 55℃纹党多糖的提取率之间差异较为明显，而55 ℃的纹党多糖的提取率最高。因此，温度选择在 45℃ 以上，考虑到酶解温度以及能量节约宜选择提取温度为 55℃。纹党多糖含量随着溶液的 pH 值的增加呈先增加后减少的趋势。当溶液的 pH 值达到 5.0 时，含量都达到较大值。当溶液的 pH 值过 5.0 时，多糖的溶出率反而减少，说明这时溶液的 pH 值过酶的最适 pH，活性开始降低，所以 pH 值为 5.0。不同酶解浓度对纹党多糖溶出率影响，纹党多糖溶出率随着复合酶的增加而增加，纹党多糖在酶添加量为 0.06g 处增加明显，在0.09g处纹党多糖溶出率有较大值，此后维持稳定。说明此时酶量足够，已经与底物充分作用，因此复合酶的酶用量为 0.09g。
2.3 纹党多糖提取工艺条件响应面分析结果
以单因素结果为依据，利用 Design Expert8.0.6.1 软件设计了三因素三水平的响应面法试验，以酶解温度、酶添加量和 pH 为主要考查因素，分别用 A、B 和 C 来表示，并以 1、0、－1 表示自变量的高低水平，以纹党多糖含量为响应值，表现出 20 个试验点。从回归分析中可以得出两者的一次项、二次项有显著影响。各试验因子对响应值的影响呈显著的线性关系。各试验因子对纹党多糖(Y)的响应值的影响分别为:
Y = －2760.05 +26.80 A+ 1085.32 B + 781.48C + 10.98 AB － 0.26AC －197.25 BC － 0.25 A2－ 3679.23B2－ 75.37C2。
方差分析结果可知，模型 P ＜0.01 说明酶解温度、酶解浓度和 pH 值及其二次项对纹党多糖影响显著，而交互项无显著影响。纹党多糖模型决定系数分别为 Ｒ2= 0.9990 经拟合检验，纹党多糖:P = 0.0001，差异显著，由此说明方程很好地反映纹党多糖含量与酶解温度、酶解浓度和 pH 值之间的关系，而且根据影响纹党多糖提取率大小顺序为 B(酶添加量) ＞ A(酶解温度) ＞C(pH 值)。因此，可以应用于纹党多糖含量提取的理论预测。依据回归方程在 3 个因素的响应面图 5 ～7，相应的响应面为凹型曲面，说明纹党多糖的含量响应值存在着高值，且响应曲面的等高线中心位于 －1 ～1 之间，说明提取的最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。通过分析两者的响应面分析结果可以确定，纹党多糖的提取最优工艺参数为:酶解温度 54.36℃，酶添加量0.09g和 pH 值 4.73，在此条件下，纹党多糖的最高含量为38.3361%。
通过酶法和响应面法联用，对纹党多糖主要活性成分进行提取工艺优化研究，响应面分析结果确定了纹党多糖的提取最优工艺参数为:酶解温度 54.36℃，酶添加量 0.09g 和 pH 4.73，在此条件 下，纹 党 酶 解 后 纹 党 多 糖 的 最 高 含 量38.3361% 。
目前提取纹党多糖的方法有很多种，传统提取方法主要是水提法，操作繁琐时间长而且提取率相对较低。酶解法条件温和，操作简单，节约原材料，有较高的提取率。中药在其提取过程中会因为一些杂质类成分如淀粉、蛋白质、果胶等而影响提取液的质量，而适当的酶通过温和的酶解反应可将液体中杂质出去，从而提高体系澄清度。单独用复合酶法提取分离纹党多糖提取率相对较高，但是其耗时较长，而且酶解法中温度和 pH 值都是影响酶解产物的重要因素，它们不但影响酶的稳定性，而且还影响酶的活性中心必需基团的解离状态和底物的解离状态。在最适pH 值和温度范围内，底物才能与酶充分的结合，产生大量的产物。所以用响应面法和酶解法联用将纹党多糖进行提取工艺的优化时，将温度和 pH值设计到条件，改变了以往提取时纹党资源的严重浪费，对纹党的资源开发和利用具有重要的现实意义。
来源：惠合浓缩器
