乳粉中叶黄素的测定方法及稳定性的影响
摘要：建立一种测定配方奶粉中叶黄素质量分数的高效液相色谱方法，采用 YMCTM色谱柱(5μm，250mm × 4.6mm)，流动相为甲醇—甲基叔丁基醚(85∶ 15)，等度洗脱，流速为 1.0ml/min，检测波长445nm，该方法在 0.3 ～ 6.0mg / L 的质量范围内线性良好( Ｒ = 0.99993)，基质加标水平为 0.30μg /g、0.60μg / g、3.0μg / g 时，回收率分别介于 96.52% ～ 98.10% 之间，相对标准偏差介于 1.31% ～ 4.66% 之间，方法检出限为 0.05μg/g，说明该方法可行。同时，研究一定的温度、加热时间及光照等条件对乳粉中叶黄素稳定性的影响，得出随着温度提高、加热时间及光照时间的延长，叶黄素含量呈递减趋势，且变化显著(P ＜0.05)。
叶黄素(Lutein)作为一种天然类胡萝卜素，具有促进视力发育、降低癌症、心血管疾病等功效，广泛存在食品、保健品等领域，尤其在婴幼儿乳粉中较为常见。目前，叶黄素检测方法常用高效液相色谱法，其采用紫外检测器，蒸发光散射检测器，二管阵列检测器或液质联用等方法进行检测，一些方法在样品处理与分析过程中存有一定缺陷。因此，本文针对当前现有方法进行改进，开发出适合乳及乳制品中叶黄素检测的方法。
叶黄素具有不稳定性，常温条件下易发生降解，而国内外对于叶黄素的研究主要集中在叶黄素的提取及检测方法，外界条件对于叶黄素的影响研究报道并不多见。因此，本文通过模拟叶黄素在食用或贮藏过程中面临外界条件，考察温度、加热时间及自然光照条件对奶粉中叶黄素稳定性的影响，以此为叶黄素检测领域、食用及贮藏过程中变化情况提供参考。
1 试验材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇、甲基叔丁基醚、二氯甲烷(色谱纯);丙酮(优级纯);2，6 － 二叔丁基对甲酚(BHT):纯度＞ 99%;叶黄素:纯度≥99%，有机相滤膜(尼龙膜，0.22 μm)。
1.2 仪器与设备
Agilent 1260 型高效液相色谱仪，N-EVAP 系列德国 Organomation 氮吹仪，HWS 系列恒温水浴锅，(Hermle) Z 233M2 型微量高速型离心机。
1.3 试验方法
1.3.1 样品制备
准确称取 0.500g 样品，置于 50mL 聚丙烯离心管中，在避光条件下，加入 10mL 丙酮溶液，振荡提取 2min。以 5000r/min 低温离心 5min，移取上清液至干净的 10mL 离心管，于 30℃ 氮吹浓缩至近干，用丙酮定容至 1mL，漩涡混匀，样液经过0.22μm 滤膜，用液相色谱仪测定，外标法定量。
1.3.2 液相色谱参考条件
色谱柱:YMCTMCarotenoid(5μm，250mm × 4.6mm)(内径)或相当者;柱温 25℃;流速 1.0 mL/min;紫外检测器波长 445 nm;进样量 25μL，流动相为甲醇∶甲基叔丁基醚 =85∶15。
1.4 试验内容
1.4.1 条件的优化
参照 1.3.1 样品处理方法及 1.3.2 色谱条件，样品经加标后采用 3 水平 6 平行试验，进行检测分析，以确定分析条件可行性。
1.4.2 不同条件对叶黄素稳定性的影响
根据可行的分析条件，进一步考察加热温度(100℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃)、加热时间(0min、10min、30min、90min、120min、360min)及室温条件下光照时间(0min、10min、30 min、90min、120 min、360 min)对叶黄素稳定性的影响。
1.4.3 数据处理
各指标值测定重复 6 次(n =6)，用 EXCEL软件进行数据分析，用 SAS 9.0 软件进行 Duncan新复差分析。
2 试验结果与分析
2.1 方法的线性关系
以丙酮为溶剂，配制叶黄素标准系列:其质量浓度分别为 0.30，1.00，2.00，3.00，6.00mg/L 的标准系列，在规定的色谱条件下进行测定。同时，在 0.30 ～ 6.00mg/L 的浓度范围内，峰面积与浓度呈线性关系，其相关性系数 r = 0.99993。线性方程 Y = 0.29959116x －0.2871585，其中，式中 x 为质量浓度，Y 为峰面积。
2.2 检出限(LOD)的确定
对于奶粉，当信噪比 S/N =3，取样量为0.5g，定容体积为 1mL 时，本方法的检出限 LOD 值为5μg /100g。
2.3 回收率与精密度
选取奶粉样品，按方法确定的条件，进行 3 水平添加回收试验，每个添加水平取 6 个平行样。分别添加 0.30，0.60，3.00mg / L 叶黄素标准溶液，试样的加标回收率范围为96.52% ～ 98.10%，相对标准偏差 ＲSD 为1.31 %～ 4.66 %，该方法回收率高、重现性良好，其检测结果符合 GB/T27404 － 2008 试验室质量控制规范中食品理化检验的要求。
2.4 不同条件对乳粉中叶黄素含量的影响
2.4.1 温度对叶黄素稳定性的影响
随着温度的增加，叶黄素含量逐渐降低，当加热温度高于 95℃ 时，其含量下降迅速，且下降速率差异显著(P ＜0.05)，可以得出在一定温度范围内，叶黄素随着温度增加其降解速率加快，稳定性变差。
2.4.2 加热时间对叶黄素稳定性的影响
随着加热时间延长，叶黄素含量呈下降趋势，当加热时间高 30min 时其含量下降趋势相对平缓，可以得出叶黄素在高温条件下，随着加热时间延长其稳定性也逐渐变差。
2.4.3 光照时间对叶黄素稳定性的影响
叶黄素在光照条件下稳定性也较差，随着加热时间延长，叶黄素含量逐渐下降。可以得出叶黄素在室温条件下，随着光照时间延长，叶黄素出现一定程度降解。同时，在室温条件下，光照时间在 360min 时，叶黄素的降解率约25%，而 100℃ 加热条件下，处理时间为 360min时降解率达 60%，二者差异显著(P ＜ 0.05)。可以看出高温处理对叶黄素的破坏程度大于光照的影响。
来源：惠合浓缩器
