黑曲霉液体发酵桔粉产纤维素酶的研究

摘要：以桔粉为原料，以黑曲霉 （Aspergillus niger） 为发酵菌株，采用液体发酵法生产纤维素酶。通过单因素试验考查了麸皮和蛋白胨的比例 （C/N）、装液量及接种量 3 个因素对产酶的影响，并在此基础上，通过正交试验确定了发酵产酶的工艺条件为：添加桔粉80 g/L，麸皮和蛋白胨质量比为 1∶2、250 mL 三角瓶装 30 mL Mandels 氏营养液、接种量 3 mL，于 30 ℃下培养 72 h，纤维素酶产量达到 1885.71 U / g。
纤维素酶是具有降解含有β- 1，4 糖苷键的纤维素的一组酶的总称，广泛应用于酿造果汁与蔬菜加工、粮食加工、饲料、造纸、中草药有效成分的提取、纺织、采油工程、废水处理以及能源制造等各个方面。是柑桔生产大国，每年都会产生很大一部分落果和滞销果，这部分废弃柑桔一般都是直接扔弃，既浪费了资源，又污染了环境。
柑桔富含果胶、纤维素、可溶性糖及多种维生素和矿物元素，是一种良好的微生物生长质。黑曲霉是公认安全 （GRAS） 的微生物，用其生产酶制剂安全、可靠，不产生毒素，而且生长快、发酵周期短，具有明显的优越性。利用黑曲霉液体发酵柑桔产纤维素酶目前未见报道。本文通过黑曲霉液体发酵桔粉产纤维素酶的研究，旨在为纤维素酶的液体发酵生产提数据参考，也为废弃柑桔的综合利用开辟新的途径。

1材料与方法
1.1 材料
桔子落果，本地桔园获得，无腐烂，将其烘干磨成粉末，备用。黑曲霉 （Aspergillus niger）：本院微生物试验室保藏。
1.2 仪器设备
UV- 1801紫外 / 可见分光光度计，北京北分瑞利分析仪器公司；PYX- DHS 隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂；HH- S2 数显恒温水浴锅，金坛市鑫诺试验仪器厂；DHG- 9070B数显电热恒温干燥箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；DGX- 9143B- 1 电热恒温鼓风干燥箱，上海福玛试验设备有限公司；YX280AS 手提式不锈钢蒸汽消毒器，上海三申医疗器械有限责任公司；BS- 1E 恒温振荡培养箱，金坛市恒丰仪器厂。
1.3 培养基
1.3.1 营养液
Mandels氏营养液。
1.3.2斜面培养基
PDA培养基：马铃薯 （去皮） 200 g，葡萄糖5 g，KH2PO41 g，水 1000 mL，自然 pH，琼脂 5 g。
1.3.3发酵产酶培养基
产纤维素酶基础培养基：柑桔粉 80 g / L，其他组分按照单因素试验方案进行配置，pH 6.5。摇瓶发酵培养基：将培养好的新鲜产孢子斜面上的孢子制备成孢子悬液，按培养基体积10%(约 1.2×108个孢子)接种到产纤维素酶基础培养基中，于 30 ℃、200 r / min 振荡培养 72 h。
1.4 主要试剂
3，5- 二硝基水杨酸 （DNS） 试剂：取酒石酸钾钠 182 g，溶于 500 mL 蒸馏水中，加热。于热溶液中依次加入3，5- 二硝基水杨酸 6.3 g，氢氧化钠 10 g，苯酚 5 g，无水亚硫酸钠 5 g，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定容至 1000 mL，混匀，过滤，贮于棕色试剂瓶中，于暗处放置 72 h 后使用。柠檬酸缓冲液 （pH 4.8，0.05 mol / L）：取40 mL 0.1mol / L 柠檬酸与 60 mL 0.1 mol / L 柠檬酸三钠混合，再加 200 mL 蒸馏水稀释一倍。1%羧甲基纤维素钠 （CMC- Na） 溶液：称取1 g 羧甲基纤维素钠，精确至 1 mg，缓缓加入 pH为4.8 的柠檬酸缓冲液 80 mL，水浴加热至溶解。搅拌匀，冷却后定容至 1000 mL，再用二层纱布过滤。此溶液在 4 ℃冰箱贮存，有效期为 3 d。1 g /100mg 葡萄糖标准贮备溶液：称取预先于 （103±2） ℃下干燥至恒重的葡萄糖 1.000 g，用蒸馏水溶解后定容至100 mL，即为 1 g / 100 mL浓度的葡萄糖标准溶液。
1.5 方法
1.5.1
纤维素酶活力测定采用 DNS 法。
1.5.2 葡萄糖标准曲线的制作
分别配制 0 μg / mL、200 μg / mL、400 μg / mL、600 μg / mL、800 μg / mL、1 000 μg / mL、1 200 μg / mL标准葡萄糖使用溶液，各吸取 0.50 mL 于试管中，同时分别吸取柠檬酸缓冲液 1.5 mL、DNS 试剂3.0 mL 于上述试管中，混匀。将试管置于沸水浴中，反应 7 min，取出，迅速冷却至室温，准确加入蒸馏水 10 mL，混匀。用 10 mm 比色杯，以空白管(对照液)调仪器 零 点 ， 在 分 光 光 度 计λ=540 nm处测吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。相关系数 R2应在 0.999 0 以上时方可使用(否则须重做)。
1.5.3酶活力计算
纤维素酶活力按下式计算：
X=（A×V×N） / （0.5×W×10），
式中：X———纤维素酶活力，U / g；
A———根据吸光度在标准曲线上查得 （或从回归方程计算出） 的还原糖生成量，μg / mL；
V———样品提取时加入水的量，mL；
N———样品二次稀释时的稀释倍数；
0.5———参与反应的酶量，g；
W———样品量，g；
10———反应时间，min。
1.5.4 试验设计
1.5.5.1 单因素试验
分别考察麸皮和蛋白胨的质量比 （C/N）（A）、装液量 （B） 及接种量 （C） 三个重要因素对产酶的影响。
1.5.4.2 正交试验
在单因素试验基础上，进行 3 因素 3 水平正交试验，采用L9（34）正交表，对试验结果进行差分析，通过差分析确定方案。

2结果与讨论
2.1 葡萄糖标准曲线
按1.5.2 中的方法绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程：D（λ） =0.000 2ρ + 0.040 2，R2=0.999 6。相关系数 R2为 0.999 6，大于0.999 0，说明回归方程拟合良好，因此可以使用该葡萄糖标准曲线。
2.2 麸皮和蛋白胨的质量比 （C /N） 对产酶的影响
将麸皮 （辅助碳源） 与蛋白胨 （氮源） 按不同质量比混合成同质量浓度 （6 g / mL 固形物）的培养基。取 30 mL Mandels 氏营养液于 250 mL三角瓶中，做 7 次试验，加入麸皮与蛋白胨不同质量比的混合物，分别为 0∶6、1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5 ∶1、 6 ∶0，然后置于 30 ℃ 下振荡培养72 h，收获后测定酶活力。麸皮 （辅助碳源） 与蛋白胨 （氮源） 按 1∶2 的质量比混合使用，更有利于酶产量的提高。氮源是黑曲霉生长必需的，麸皮作为辅助碳源，可供菌体早期迅速生长并促进产酶，故选用高氮低辅助碳的培养基较为适合。
2.3 装液量对产酶的影响
在250 mL 的三角瓶中分别加入 20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL 的 Mandels 氏营养液(发酵液)，按 80 g / L 加入桔粉、按 6 g / 100 mL 加入麸皮及蛋白胨组成培养基，并接入等量的孢子，置于30 ℃下振荡培养 72 h，收获后测定酶活力。装液量 30 mL 黑曲霉产纤维素酶的产量最高。由 30 mL 至 60 mL 来看，随着装液量的增加，酶活力减少，说明黑曲霉的生长和产酶的多少都与通气量有很大关系；装液量为 20 mL时酶活力比装液量为 60 mL 时的要高，这是因为发酵培养过程中一直处于恒温状态，会导致部分失水，所以对发酵过程造成一定的影响。因此装液量选择 30 mL。
2.4 接种量对产酶的影响
分别在装好桔粉和麸皮蛋白胨混合物的 250 mL三角瓶中加入 30 mL Mandels 氏营养液，再分别接入 1.5 mL、3 mL、4.5 mL、6 mL、7.5 mL 种子液，然后置于 30 ℃下振荡培养，进行发酵培养72 h，收获后测定酶比活力。当接种量为 Mandels 氏营养液体积的 10%时，黑曲霉的产酶量最高；接种量大于 15%时，酶活力开始下降。这说明在一定的环境条件下，底物量一定时，微生物种群达到一定数量将会对其本身产生抑制作用，对其生长和产酶都有一定程度的不利影响，故选择 10%接种量为佳 （即接种量为3 mL）。
2.5 发酵培养基优化正交试验
在单因素影响发酵产酶的研究基础上，以发酵培养基的麸皮和蛋白胨质量比、装液量及接种量 3 因素作为影响黑曲霉发酵生产纤维素酶的主要的因子，设计3因素 3 水平的正交试验，采用L9（34）表，差分析表明，各因素对产酶影响的主次顺序为：A＞C＞B，最优水平为 A1C1B1，即麸皮和蛋白胨质量比为 1∶2，接种量为 3 mL，装液量30 mL。
此方案在正交试验范围内，此条件下所得酶活力为1 885.71 U / g。

来源：惠合浓缩器