发酵法生产番茄红素工艺的研究

摘要：研究了应用三孢布拉氏霉菌生产番茄红素的发酵工艺条件和流加工艺。结果表明，发酵工艺条件，温度 28 ℃，搅拌速度 270 r/min，pH 6.5，接种量 10 ％ （体积比）；流加工艺是最适流加时间为发酵后 48 h，糖液流加量 6 L，发酵时间为 120 h。
番茄红素 （Lycopene） 存在于成熟番茄中，是一种脂溶性不饱和碳氢化合物，属于类胡萝卜素的一种。研究表明，番茄红素除可作为天然食用色素使用外，还具有许多生物学活性。在所有的类胡萝卜素中，他是最强的单线态氧淬灭剂，抗氧化能力也最强。有研究表明番茄红素对前列腺癌、乳腺癌、以及胰腺癌等癌症的癌细胞具有抑制作用，对
于预防和治疗心脑血管疾病、动脉硬化和肿瘤等具有重要的作用。由于番茄红素兼具较高的营养价值和药用价值，目前被广泛应用于食品、医药、化妆品和保健品行业。在番茄红素的生产方法中，以微生物发酵法生产番茄红素的成本低、安全及工艺最简单，成为研究的热点。三孢布拉氏霉菌 （Blakes-lea trispora） 是现阶段能够实现番茄红素工业化生产的高产丝状真菌。
根据其代谢途径，在发酵过程中添加合适的含氮杂环类阻断剂 （烟碱、吡啶及其衍生物） 阻断番茄红素到 β- 胡萝卜素的两步环化反应，将代谢控制在番茄红素阶段，即可通过发酵得到番茄红素。
本实验目的是在确定发酵工艺条件的基础上，在发酵过程中通过流加碳源和氮源等营养物质，改善发酵液的营养状况，延长菌群的对数生长期，同时通过培养条件的优化，进而提高番茄红素的发酵量。

1 材料与方法
1.1 实验材料
三孢布拉氏霉菌 （+） 和 （-） 菌，购自 ATCC。
1.2 仪器和设备
恒温培养箱、恒温摇床、30 L 全自动发酵罐、净工作台、干燥箱、真空冷冻干燥机。
1.3 培养基：
1.3.1 土豆培养基 （PDA）
土豆提取液1.0 L、葡萄糖 20 g、琼脂 20 g、VB少许，在 121 ℃灭菌 30 min、备用。
1.3.2种子培养基
淀粉 40 g/L、玉米浆 40 g/L、葡萄糖 25 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.25 g/L、VB少许，pH 6.5，在 121 ℃灭菌 30 min，备用。
1.3.3 初始发酵培养基
淀粉 10 g/L、淀粉糖化液 30 g/L、玉米浆 40g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.25 g/L、VB少许，pH6.5。
1.3.4 流加糖液
淀粉经糖化后，制成 300 g/L 的葡萄糖液，灭菌后备用。
1.4 实验方法
1.4.1 培养方法
1.4.1.1孢子悬浮液制备
将三孢布拉氏霉菌（+）、（-）原菌经活化后，分别接种于 PDA 斜面培养基上，在 28 ℃条件下，培养箱中培养 72 h，然后在有氧、有光的环境中，于18 ℃再继续培养 48 h，可得生长良好的（+）、（-）菌孢子，分别挑取（+）、（-）的孢子囊接入已灭菌的生理盐水中，并用磁力搅拌器搅拌，制得孢子悬浮液。
1.4.1.2 发酵培养
将培养良好的（+）、（-）菌孢子悬浮液在无菌条件下按 1∶2 的体积比混合制成种子液。在 30 L 的发酵罐中加入 5 L 初始发酵培养基，经 121 ℃、30 min灭菌后，在无菌条件下接入种子液，在 28 ℃条件下进行发酵。
1.4.3流加工艺的确定
在发酵时，按一定的时间、一定的速度流加糖液，且在发酵 60 h 时，添加阻断剂。
采用正交实验的方法分别考察糖液流加起始时间、流加糖量、发酵时间对发酵生物量以及番茄红素含量的影响，并利用正交实验的结果优化流加条件。
1.4.4接种量的确定
在确定的发酵条件下分别按体积比接种4%、7%、10 %、13 %、16 %的孢子悬浮液，28 ℃进行搅拌培养，测定菌种干重和番茄红素含量。
1.5 分析方法
1.5.1 孢子计数
微生物平板计数法。
1.5.2 细胞质量浓度测定
将发酵液抽滤得到的湿菌体，用冷冻干燥机干燥，恒定质量后称干质量，除以所取发酵液体积。
1.5.3 番茄红素的测定
分别取 1 mL 发酵液用纱布过滤后，在 45 ℃条件下烘干。将粉碎后的干菌体和适量石油醚混合，加入研钵中研磨，至溶液无色时为止。将溶液过滤，并转入 25 mL 棕色容量瓶中，用石油醚定容。以石油醚为参照在 502 nm处测定吸光光度值。

2 结果与讨论
2.1 培养条件的优化
在有氧发酵过程中，培养条件直接影响细胞的生长和代谢。因而，培养条件优化是必要的，我们分别对发酵培养基的 pH、发酵温度、接种量、转速等影响因素进行测试。
2.1.1 pH 对发酵的影响
在一定条件下，考察了发酵液起始 pH 从 5.0变化到 7.5 对发酵的影响。
发酵起始的 pH 是 6.5，而当pH 偏碱或偏酸后，菌体生长繁殖能力明显下降。
2.1.2 培养温度对发酵的影响
对同一微生物来说，不同的生理生化过程有着不同的最适温度。因此，选择在 24℃、26℃、28℃、30℃、32℃等温度条件下进行接种、培养，测定细胞质量浓度。
三孢布拉氏霉菌的培养温度为 28 ℃，三孢布拉氏霉菌最适培养温度范围较窄，生产中控制温度变化越精确越好。
2.1.3 搅拌转速对发酵的影响
对于好氧菌来说，发酵液的溶氧是影响其发酵的重要因素之一。在发酵培养过程中，可以通过调节转速考察溶氧对发酵的影响。
从转速对发酵的影响来看，随着转速的提高，单位发酵液中细胞数增加，这说明三孢布拉氏霉菌对氧的需求量是很大的。但过度的转速对设备的要求较高。因而，综合各因素选择转速为 270 r/min 进行试验。
2.1.4 接种量对发酵的影响
接种量的大小决定于生产菌种在发酵过程中生长繁殖的速度。我们选择 4 ％、7 ％、10 ％、13 %、16 %接种量 （体积比），考察接种量对发酵的影响。
大的接种量发酵，虽然可以缩短菌丝体达到高峰的时间，使得产物提早形成。同时，种子液中含有大量的体外水解酶类，有利于基质的利用。但是，接种量过多，往往使菌体生长过快、培养液粘度增加，造成溶解氧不足，而影响产物生成。若接种量过小，也不利于菌种的生长。10 % （体积比） 的接种量利于菌种的生长和发酵。
2.2 流加工艺的优化
三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素流加工艺中，在确定发酵温度、pH、搅拌速度、接种量的情况下，按正交设计方案流加糖液，以确定的流加时间、流加量及发酵时间。正交实验(正交表略)结果表明流加工艺条件为流加时间 48 h、流加糖量 6 L、发酵时间 120 h。若糖量流加过多，糖的浓度高，反而会抑制菌种的生长繁殖，使产物生成量减少。

来源：惠合浓缩器