β-环糊精对连翘酯苷包合作用的研究

摘要：研究 β- 环糊精在溶液中对连翘酯苷的包合作用。采用等摩尔系列法考察了主客分子的包合摩尔比，通过荧光光谱研究连翘酯苷 /β- CD在不同条件下的包合作用。在不同 pH 值、不同温度、不同离子强度等条件下计算包合表观稳定常数，包合过程的热力学参数为：ΔH =- 22.92 kJ/mol，ΔS =- 22.70 J/mol，且不同温度条件下的 ΔG 小于零。结论：β- CD 与连翘酯苷形成摩尔比为1∶1 的包合物，包合过程为放热过程，而且是自发进行。

连翘酯苷是连翘中的一个主要有效成分，具有多种生物活性，如抗真菌、抗病毒作用，抗感染、解热作用，抑菌作用。最近研究发现连翘酯苷还具有较强的抗氧化活性，有望开发为一种天然的抗氧化剂。连翘酯苷为咖啡酸的衍生物，分子结构具有酯键和多个酚羟基，在储存和制备过程中易被氧化，限制了在药学中的应用。故需采用一定的制剂技术以提高药物稳定性。β- 环糊精(β- cyclodex-trin，β- CD)是一种安全、有效、低毒的药物载体，并且能包合一定大小的药物分子，形成一种的包合物，从而改变药物的特性，增加药物的溶解度和生物利用度，提高药物稳定性。本文采用荧光光谱法探讨了影响 β- CD 包合连翘酯苷的作用因素，计算了表观稳定常数与热力学参数，为研制 β- 环糊精 / 连翘酯苷包合物制剂提供了依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

F—2500 荧光光度仪，日本 HITACHI；pH 计，上海盛磁科技有限公司；旋转蒸发器 RE- 52A，上海亚荣生化仪器厂；冷冻干燥仪，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 药品与试剂

连翘酯苷 （本试验室自制，纯度达 95 g/100 g）；β—CD（北京化学试剂公司，分析纯）；聚酰胺薄膜和聚酰胺树脂，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂出品；MDS，北京麦迪生新技术开发中心；其余试剂为分析纯。

1.3 实验部分

1.3.1 连翘酯苷的制备

连翘果实适当粉碎，用体积分数 40%乙醇回流提取 2 次，过滤，滤液减压浓缩回收乙醇，浓缩至一定体积后，质量分数为 70%乙醇醇沉，过滤。滤液减压浓缩至适当体积后用聚酰胺树脂进行初步分离，得连翘酯苷粗品。上述粗品进一步采用 MDS柱层析分离纯化，得淡黄色连翘酯苷。UV、IR、NMR 进行结构鉴定，结果与文献报道，HPLC测定含量达 95 g/100 g以上。

1.3.2 连续变化法测定包合比

准确称取连翘酯苷和 β—CD，用蒸馏水配制浓度为 1×10- 3mol/L 的标准溶液。保持连翘酯苷和环糊精总摩尔浓度 （1×10- 4mol/L） 不变的情况下，将上述两标准溶液按一定体积比例混合，配制摩尔分数 （f）在 0~1 的连翘酯苷系列混合溶液。然后在 F2500 型荧光仪上测定混合溶液和相对应浓度连翘酯苷溶液的荧光强度。最后以连翘酯苷溶液与对应相同浓度混合液的荧光强度之差对 f作图，则 ΔF 呈较大值处对应的f即为包合物组成的摩尔比。测定条件为：激发波长为 320 nm，发射波长为 450 nm，狭缝宽度为 10 nm，10 nm。

1.3.3 连翘酯苷 /β- CD 表观稳定常数的测定

1.3.3.1 实验方法

用蒸馏水配制浓度分别为 1×10- 3mol/L、1× 10- 2mol/L 的标准溶液。准确移取 0.1 mL（1.0× 10- 3mol/L）的连翘酯苷溶液于 10 mL 比色管中，分别加入不同体积的 β- CD 标准溶液且 β- CD 的浓度范围为3×10- 4mol/L ~ 5×10- 5mol/L。用双蒸水定容至刻度，摇匀，(28±1) ℃下，静置 1 h，在激发波长为325 nm，发射波长为 450 nm 的条件下测定溶液的荧光强度(F)，在相同条件下作试剂空白(F0)，计算ΔF。狭缝宽度分别为 10 nm，10 nm。

1.3.3.2 表观稳定常数的确定

表观稳定常数(K)是衡量包合物稳定性的重要参数，表示溶液中游离药物分子与被包合的药物分子之间存在一个动态平衡，K 值越大，β- CD 对药物稳定作用越强。β- CD 与连翘酯苷在水溶液中的包合是一个平衡过程，其包合常数 K 可用公式:1/F- F0=1/(Kk[P]0[CD]0)+1/(KQ[P]0)求得。其中[P]0为连翘酯苷的起始浓度，[CD]0为 β- CD 的浓度，F0和F 分别为 CDs 不存在和不同浓度时溶液的荧光强度，k 和 Q 为常数，K 为包合常数。根据上述公式：以 1/ΔF 对 1/[CD]作线性回归，由截距除以斜率得连翘酯苷 /β- CD的包合常数。

1.3.4 pH 值对包合常数的影响

用 pH 值为 3、4、5、6、7 的磷酸氢二钾 / 柠檬酸缓冲溶液，分别配制一系列连翘酯苷和 β- CD标准溶液，使其浓度分别为 1.0×10- 3mol/L、1.0×10- 2mol/L。固定连翘酯苷溶液浓度为 1×10- 5mol/L，依次加入不同浓度为 1×10- 2mol/L 的 β- CD 溶液，然后用不同 pH 值的缓冲溶液定容至刻度，按1.3.3 项测定各溶液的荧光强度。

1.3.5 离子强度对包合常数的影响

用浓度分别为 0.02 mol/L，0.04 mol/L，0.08 mol/L，0.1 mol/L，0.2 mol/L，0.3 mol/L，0.4 mol/L，0.5 mol/L的NaCl 溶 液 配 制 浓 度 分 别 为 1.0 ×10- 3mol/L，1.0×10- 2mol/L 连翘酯苷和 β- CD 标准溶液，按1.3.3 方法和条件，测定各溶液的荧光强度。

1.3.6 温度对包合常数的影响及热力学常数的测定

以 pH 值为 5、浓度为（0.08mo·lL- 1）/（0.04mo·lL- 1）的磷酸氢二钾 / 柠檬酸缓冲液配制浓度分别为1.0×10- 3mol/L，1.0×10- 2mol/L 连翘酯苷和 β- CD储备标准溶液，按 1.3.3 方法和条件，分别在 19 ℃、29 ℃、40 ℃静置 1 h，然后测定其溶液的荧光强度。根据不同温度下的 K 值，利用公式 ΔG=- RTInK，求得不同温度下的 ΔG 值，再由公式：ΔG/T=ΔHT- ΔS，以 ΔG /T 对 1/T 作图得到一条直线，斜率为 ΔH，截距为 – ΔS。

2 结果与分析

2.1 连翘酯苷与 β-CD 的包合比

相对荧光强度变化的较大值处对应连翘酯苷的摩尔分数 f＝0.5，说明连翘酯苷和环糊精的包合比为 1∶1。

2.2 连翘酯苷 /β-CD 表观稳定常数的测定

随着 β- CD浓度的增加，连翘酯苷的荧光发射峰发生了蓝移，同时相对荧光强度增加，说明连翘酯苷和 β- CD 发生作用形成了包合物。同时可看出，当 β- CD 浓度增加到一定浓度时，连翘酯苷相对荧光强度增加不明显，说明包合反应已经趋于完成。根据 1/ΔF 对 1/[CD]的线性回归,线性方程为：y=5×10- 5x+0.03343(r=0.9973)。由截距除以斜率得连翘酯苷 /β- CD 的包合常数 K 为668.6M- 1。

2.3 pH 值对包合常数的影响

在 pH 值为 5 时，K 值较大，说明连翘酯苷分子主要以游离态存在；而在 pH 值小于 5 及 pH 值大于 5 时，K值都较小，说明连翘酯苷分子分别主要以质子化和解离态存在；因为游离的分子型药物较离子型药物更容易被包合,所以在 pH 值为 5 时表观稳定常数较大。

2.4 离子强度对包合常数的影响

起初随离子强度增加，表观稳定常数增大，说明离子强度对包合有较大影响。但随着离子强度的进一步增加 （大于 0.1 mol/L），K值又逐渐降低。这一变化的原因可能是由于连翘酯苷本身水溶性较好，当增加一定浓度的 NaCl 溶液时，降低了连翘酯苷的溶解度，有利于包合反应的进行。随着离子强度的不断增加，溶液的性提高有利于 β- CD 分子间疏水作用，隐蔽了 β- CD 分子与连翘酯苷分子之间的相互作用，导致包合常数的降低。

2.5 温度对包合常数的影响

随着温度的升高，表观稳定常数降低，说明升高温度不利于包合。

2.6 包合过程的热力学参数

在反应温度范围内：①随着温度的升高，稳定常数减小。这说明温度升高，分子运动的无序性增加，不利于包合反应进行，并且包合物趋于离解，包合物的稳定性降低。②ΔG 为负值，表明包合反应可自发进行。③ΔS 为负值，这是分子体系不同于通常的自发体系的一个特征，说明反应体系的混乱度减小，客体分子的运动在环糊精空腔中受到限制。④ΔH 为负值，说明包合物的形成过程是放热过程，适当降低温度有利于包合反应的进行。

来源：惠合浓缩器